Разработка количественного мультиплексного RT

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 12073 (2023) Цитировать эту статью

299 доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Гепатит Дельта — это заболевание, вызванное воздействием вирусов гепатита B (HBV) и гепатита D (HDV), обычно с более тяжелым клиническим исходом по сравнению с моноинфекцией HBV. На сегодняшний день реальная распространенность инфекции HDV недооценена, а методы выявления плохо доступны, особенно в более эндемичных регионах. Поэтому был разработан одноэтапный метод RT-qPCR для количественного определения HDV-РНК. Биологические образцы были отобраны в период с 2017 по 2023 год у пациентов в Ambulatorio Especializado em Hepatites Virais Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia и Serviço de Assistência Especializada и прошли тест, разработанный в рамках этого исследования, и второй количественный анализ RT-qPCR. Наклон исходного количественного анализа составил - 3,321 с эффективностью 100,04% и коэффициентом амплификации, равным 2. Анализ данных повторяемости выявил предел количественного определения 5 копий/реакцию и предел обнаружения (95%) 2,83 копий на реакцию. реакция. Точность диагностических тестов на чувствительность составила 97,37% по сравнению с эталонным тестом. Этот анализ оказался высокоэффективным и воспроизводимым, что делает его ценным инструментом для наблюдения за пациентами с гепатитом Дельта и оценки риска прогрессирования заболевания, а также эффективности лечения.

Вирус гепатита дельта (HDV), отнесенный к роду Deltavirus, является атипичным, содержит около 1700 нуклеотидов одной цепи РНК отрицательной полярности размером от 36 до 43 нм и по своей внешней структуре представляет поверхностные белки вируса гепатита B (HBV). )1,2. Заражению HDV предшествует предыдущий контакт, текущее или одновременное инфицирование HBV. Обычно его клинический исход будет более тяжелым и характеризуется ускоренным прогрессированием до цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с моноинфекцией ВГВ3,4,5.

В настоящее время трудно точно оценить распространенность HDV во всем мире; по меньшей мере от 12 до 15 миллионов человек могут быть инфицированы этим вирусом, который распространен в Африке, Азии, Северной и Южной Америке, Восточном Средиземноморье и Европе6,7. В Южной Америке эндемичная зона HDV расположена на севере (регион бассейна Амазонки) и охватывает несколько стран5,8,9,10. В Бразилии в период с 2000 по 2021 год число зарегистрированных случаев составило 4259. Эти цифры можно считать заниженными, поскольку это заболевание остается игнорируемым по всей стране и не ведется активный поиск пациентов, моноинфицированных ВГВ, для выявления коинфекций11.

Серологический диагноз инфекции HDV основан на обнаружении тотальных антител против HDV в сыворотке крови. Наличие HDAg в ткани печени также является клиническим показателем, позволяющим подтвердить инфекцию с помощью эластографии печени, неинвазивного и безболезненного метода, позволяющего оценить степень фиброза печени4,12. При обнаружении антител против HDV используется молекулярная диагностика для подтверждения или исключения активной инфекции. Молекулярный тест проводится путем поиска РНК HDV в плазме, количественного определения с помощью метода RT-qPCR; однако это не является общепринятым, поскольку в Бразильском агентстве по надзору за здоровьем (Anvisa) не зарегистрированы наборы. Использование молекулярных методов для количественного определения HDV в ограниченных областях, где специализированные специалисты могут разработать собственные тесты, также является ограничивающим фактором13.

Таким образом, молекулярная диагностика HDV остается сложной задачей, поскольку она не является широко доступной в эндемичных районах региона Амазонки. Целью исследования была разработка высокочувствительного количественного мультиплексного одноэтапного анализа RT-qPCR для диагностики и наблюдения за пациентами с гепатитом Дельта.

Плазмиду тестировали с интервалами 1 × 105 и 1,25 копий на реакцию (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 и 1,25) для определения эффективности и линейности амплификации. Все точки на кривой количественного определения с количеством копий выше 5 на реакцию имели 100% амплификацию в различных анализах. Наклон исходного количественного теста составил - 3,321 при эффективности 100,04%, коэффициенте корреляции прямой (R2) равном 0,99 и коэффициенте усиления равном 2 (см. рис. 1).